Исследования in vivo

Исследования in vivo

In Vitro and In Vivo Studies of a Rapid and Selective Breath Test for Tuberculosis Based upon Mycobacterial CO Dehydrogenase
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3993857/

M.M. и S.W.C. внесли одинаковый вклад в эту статью.

Редактор Эрик Рубин, Гарвардская школа общественного здравоохранения

Одним из основных препятствий при лечении туберкулеза (ТБ) является трудоемкая и сложная методология диагностики. Испытания на стойкое изотопное дыхание обладают большим потенциалом для быстрой диагностики инфекционного заболевания, мониторинга терапии и определения бактериального фенотипа в быстром, точном методе лечения, который не требует инвазивной выборки. Здесь мы описываем доклиническое развитие потенциально высокоселективного теста на диагностическое дыхание ТБ, основанного на активности дегидрогеназы организма. После разработки теста in vitro мы смогли использовать тест на дыхание, чтобы различать зараженных и контрольных кроликов, демонстрируя, что потенциально может быть поставлен диагноз, а также, что сложный бактериальный фенотип может быть неинвазивно и быстро изучен на хозяине.

Туберкулез (ТБ) по-прежнему является главной инфекционной причиной болезней и смертей во всем мире, и эффективный диагноз, а затем лечение — это инструменты, с помощью которых мы боремся с ТБ. Чем быстрее и конкретнее диагноз может быть сделан, тем лучше, и это также верно для того, чтобы диагноз был как можно ближе к пациенту (точка зрения). Здесь мы сообщаем о нашем доклиническом развитии тестов на дыхание, основанных на специфическом метаболизме микобактерий, которые могли бы, с развитием, обеспечить быструю диагностику точки опоры путем измерения микобактериальной конверсии маркированного СО с маркировкой СО2.

Борьба с туберкулезом (ТБ) активизировалась благодаря широким и устойчивым исследовательским усилиям, которые привели к появлению ряда новых лекарств, получивших одобрение регулирующих органов (bedaquiline, delamanid) или в настоящее время проходящих более поздние клинические испытания (например, PA824 и SQ109), с гораздо большим числом доклинических и фаз 1. Тем не менее, существует вероятность того, что этот всплеск творчества будет сильно затруднен в процессе клинических испытаний. Существует большая сложность при проведении фаз 2, фазы 3 и послеприобретенных испытаний всех этих агентов в потенциально широком диапазоне комбинаций лекарств, возможных с организмами, которые имеют ряд фенотипов лекарственной устойчивости (восприимчивых, монорезистентных, устойчивых к множественным лекарственным средствам, резистентных к лекарственным средствам) , Даже с инновационными пробными проектами (1) эта сложность может затруднить подбор персонала и анализ конечных точек. Усугублением этой проблемы являются значительные дефициты в текущих конечных точках эффективности в клинических испытаниях — положительная активность мазка мокроты, ранняя бактерицидная активность или переход к отрицательной культуре мокроты после двухмесячного лечения, — которые побудили к поиску новых и лучших биомаркеров (2 -4). Конечно, после того, как они были установлены и подтверждены, эти биомаркеры могут оказаться полезными при диагностике или лечении вне клинических испытаний.

Кроме того, многие из наиболее часто используемых методов диагностики туберкулеза далеки от идеальных, что приводит к диагностическим задержкам, которые могут позволить передачу и привести к неадекватным антибиотикотерапиям, которые позволяют сопротивляться развитию (5). Улучшение быстрых и специфических методов диагностики на основе дыхания также может оказать значительное влияние на увеличение скорости диагностики.

Недавно наши группы сообщили о доклинических исследованиях на основе метода испытаний на стабильный изотопный дыхательный раствор, который доставлял [13C] мочевину непосредственно в легкие, где он подвергался конверсии с помощью микобактериальной вирулентности уреазы до 13CO2. Определив степень обогащения 13CO2 при дыхании, можно было отслеживать прогрессирование инфекции, эффективное лечение и имитируемую неудачу лечения в модели кролика (6). Поскольку тест может быть выполнен быстро, используя одобренные детекторы точки доступа (POC), клинический перевод этого подхода продолжается (с использованием устного пути доставки для мочевины из-за проблем регулирования) для определения чувствительности и специфичности у людей (регистрация клинических испытаний номер NCT01301144).

Однако уреаза выражается рядом патогенов как легкого, таких как Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii (7, 8) и Klebsiella pneumoniae (9), так и других сайтов, таких как желудочно-кишечный (GI) патоген Helicobacter pylori ( 10). Ожидается, что непосредственная доставка легких [13C] мочевины (как распыленного раствора или вдыхаемого сухого порошка) будет приводить к специфике легких и обходить ложную положительность от экспрессионов GI-уреазы, более специфическая химия-мишень будет обходить ложные срабатывания от легочных инфекций с помощью экспрессиологов уреазы, таких как P. aeruginosa.

Обширный геномный и метаботомный поиск подтвердил гипотезу о том, что фермент CO-дегидрогеназа (CODH) может обеспечить подходящий и высокоспецифический метаболический путь для выявления ТБ. Этот фермент окисляет CO до CO2, как в реакционной схеме 1 (CO + H2O → CO2 + 2H + + 2e-), а активность сообщается несколькими группами (11-13) у нескольких видов авирулентных и экологических микобактерий.

Прогнозируемые активные (непсевдоодные) гены для больших, малых и средних субъединиц CODH встречаются в геномах нескольких вирулентных туберкулезных микобактерий, таких как Rv0373c, Rv0374c и Rv0375c, соответственно, в Mycobacterium tuberculosis с аналогами вирулентных штаммов Mycobacterium bovis и штамм вакцины M. bovis BCG. Поэтому мы предположили, что, используя подходящий стабильный изотопически меченный СО, мы могли бы использовать микобактериальное превращение меченого СО в меченый СО2 как гораздо более специфический маркер для микобактериальных легочных инфекций и обеспечить улучшенное испытание на дыхание для диагностики ТБ (таблица 1).

Общие патогены легких, экспрессирующие уреазу, не выражают CODHa

Данные собираются из предшествующей работы, обсуждая гены или ферментативную активность. В этой работе тестировались только гены, и ни один из тестируемых штаммов не выражал CODH.

Хотя известно, что он является токсичным газом в достаточном количестве, CO эндогенно продуцируется гемоксигеназой и при ограниченном воздействии также широко используется клинически для измерения способности к диффузии легких (14), особенно у пациентов с ТБ (15). Таким образом, с этим прецедентом, клинический перевод может быть возможен при тщательной оценке коэффициентов риска / выгоды. Как обсуждается позже, насыщение CO-гемоглобином у обработанных CO кроликов, используемых при детектировании, варьировало от 9 до 18%; в сравнении, тяжелые курильщики достигают 15% насыщения (16).

Первоначально конверсия 13CO-13CO2 измерялась in vitro в M. bovis BCG и демонстрировала ожидаемое увеличение свободного пространства δ-13CO2, которое зависело от дозы 13CO (фиг.1A), плотности бактерий (фиг.1B) и времени инкубации (рис. 1С). Однако величина увеличения δ-13CO2 была намного ниже, чем мы наблюдали ранее in vitro с использованием [13C] мочевины (6). Это показало, что если использовать в качестве теста на дыхание in vivo (где любой CCOH-производный 13CO2 будет смешан с большим количеством выдыхаемого СО2), изменения в δ-13CO2 не будут обнаружены.

Доза, КОЕ и временная зависимость активности CODH с использованием 13CO. (A) M. bovis BCG (3 мл, 1 × 107 КОЕ / мл) инкубировали с увеличением дозы 13CO при 37 ° C в течение 4 часов. Пространственное пространство δ-13CO2 определяли по IRMS. Числа означают ± SD (n = 4) результатов от отдельных биологических повторов. Однофакторным ANOVA с тестом Tukey в качестве пост-hoc-теста P был

Чтобы повысить чувствительность обнаружения CODH в формате тестирования дыхания, было очевидно, что потребуется измерение редкого изотополога СО2, чтобы можно было наблюдать сигнал, полученный из CODH. Было предсказано, что конверсия 13C18O-13C18O16O с помощью CODH позволит значительно увеличить чувствительность из-за чрезвычайно низкого содержания изотопа 13C18O16O в природе. Только около 0,002% выдыхаемого метаболического CO2 из не-CODH-источников будет 13C18O16O.

Чтобы проверить потенциал теста на измерение дыхания, мы проверили ключевые особенности анализа in vitro, а именно зависимость Δ47 (индекс метаболизма CODH от 13C18O до 13C18O16O): (i) доза используемого 13C18O, для понимания пределов чувствительности; (ii) плотность бактерий (измеренная как количество КОЕ / мл), так как крайне желательно, чтобы величина δ47 изменялась с бактериальной нагрузкой, так что можно было наблюдать реакцию на лечение {δ47 = 1000 ⋅ [rR47 / 44 (образец ) — rR47 / 44 (стандарт)], разделенный на rR47 / 44 (стандарт), где rR47 / 44 — относительное отношение масс 47 (13C18O16O) и 44 (CO2)}; и (iii) время инкубации, так что используются соответствующие моменты времени после введения для измерений in vivo.

На рисунке 2 показано соотношение между дозой 13C18O и свободным пространством Δ47 выше, чем у культур M. bovis BCG, с линейной зависимостью от выбранного диапазона дозы. Это указывает на то, что в рамках эксперимента насыщение способности анализа сообщать о CODH не происходит, так что повышенная чувствительность in vivo должна достигаться с использованием более 13C18O (хотя общая доза будет ограничена токсичностью СО). Связь между бактериальной плотностью и свободным пространством Δ47 выше, чем у культур M. bovis BCG, показана на рисунке 3, демонстрируя, что анализ будет способен обнаруживать уменьшающиеся уровни бактерий во время лечения наркотиками и что 6 × 105 общего КОЕ были легко обнаружены , От 107 до 109 бацилл можно регулярно культивировать из единственной легочной полости человека (17), поэтому чувствительность к анализу может быть подходящей. Сигнал Δ47 насыщается от 106 до 107 КОЕ / мл в этом анализе in vitro, хотя пока неясно, почему это происходит.

13C18O. M. bovis BCG (3 мл, 1 × 107 КОЕ / мл) инкубировали с газом 13C18O в течение 22 часов. Газообразный газ анализировали с помощью масс-спектрометрии изотопного отношения (IRMS) для определения Δ47. Данные представляют собой ± SD (n = 4) результатов от отдельных биологических повторов. Однофакторным ANOVA с тестом Tukey в качестве пост-hoc-теста (ANOVA между группами) P был

Клеточная плотность-зависимая конверсия 13C18O-13C18O16O. M. bovis. Культуру BCG (6 мл) инкубировали с 1 мл газа 13C18O в течение 0,5 часа. Газообразный газ измеряли для определения Δ47. Данные представляют собой ± SD (n = 4) результатов от отдельных биологических повторов. Однофакторным ANOVA с тестом Tukey в качестве пост-hoc-теста P был

Временная зависимость метаболизма 13C18O (скорректированная на количество присутствующего CFU и доза CO) для диапазона микобактерий показана на рисунке 4. Можно видеть, что Δ47 быстро возрастает для всех изученных видов, за которым следует снижение , Причины более низких значений для M. tuberculosis, чем для штаммов M. bovis, неизвестны и могут быть сложными, включая относительную потерю активности сильно адаптированного к лабораторным нагрузкам штамма H37Rv. В этом свете относительные оценки активности между видами и штаммами должны проводиться in vivo, где наложенные на организм CODH-давления могут приводить к повышению регуляции, хотя это выходит за рамки этой работы. Мы не смогли измерить конверсию 13C18O в 13C18O16O в аналогично обработанных культурах Pseudomonas aeruginosa или Escherichia coli. Это согласуется ни с одним из геномов этих организмов, обладающих любыми известными генами CODH.

Временное преобразование 13C18O в массу 47 (13C18OO). M. bovis BCG или M. tuberculosis H37Rv (6 мл, 3 × 107 КОЕ / мл) инкубировали с 1 мл газа 13C18O; M. bovis Ravenel (3 мл 1 × 108 КОЕ / мл) инкубировали с 3 мл 13 С18О. Измеряли газообразный пробег Δ47 и измеряли Δ47 на 1 × 108 КОЕ на мл добавленного СО. Данные представляют собой ± SD (n = 4) результатов от отдельных биологических повторов. Однофакторным ANOVA с тестом Tukey в качестве пост-hoc-теста, в течение 0 ч против 0,5 ч, P был

Быстрая кинетика конверсии поддерживала потенциал этого анализа, чтобы обеспечить быстрое испытание на дыхание, с длительными периодами после того, как управление трассером, вероятно, будет ненужным. Однако снижение в 4 часа было неожиданным и не было замечено для мер 13CO-13CO2 (фиг.1A). Мы предположили, что потеря сигнала δ47 вызвана потерей 18O 13C18O16O, катализируемой последовательной гидратацией и дегидратацией CO2 ферментом карбоангидразой, как показано на схеме реакции 2 (18): 13C18O16O + H216O → H213C18O16O2 и H213C18O16O2 → 13C16O2 + H218O. Таким образом, потеря 18O из 13C18O16O уменьшила бы Δ47 со временем, но не значение δ-13C, что и было обнаружено. Углеродные ангидразы являются вездесущими ферментами, которые, как известно, экспрессируются и активны в микобактериях, таких как M. tuberculosis (19), и представляют собой потенциальные мишени против туберкулеза. Однако, несмотря на то, что препараты ингибитора карбоангидразы, такие как ацетазоламид (диамокс), ингибируют выделенные бактериальные ферменты in vitro (20), они не оказывали влияния на целые клетки M. tuberculosis из-за их неспособности проникнуть в стенку клеток восковой миколиновой кислоты (19 ). Соответственно, концентрации ацетазоламида до 9 мМ не наблюдали влияния на потерю Δ47, связанного с более длительным временем инкубации (не показано). Однако, как известно, известно, что легкие обладают высокой степенью активности карбоангидразы (21), которые будут иметь подобные эффекты, более поздние исследования in vivo использовали предварительную обработку ацетазоламидом в ранее подтвержденной дозе (22) для ингибирования любой потери углекислого ангидраза легкого δ47, которая снижение обнаружения.

Группы кроликов были назначены контрольной группе (без инфекции) или инфицированы вирулентным M. bovis Ravenel, что было показано нашей группой как очень представительная модель кроликов состояния болезни человека (23, 24). Приблизительно от 107 до 109 бацилл обычно можно культивировать из единственной легочной полости человека (17), тогда как в этой модели инфекции M. bovis генерировали половые КОЭ-счета от 106 до 109 бацилл. На рисунке 5 показано δ47 в образцах выдыхаемого воздуха двух групп после введения 13C18O, которое увеличилось в течение 15 минут в инфицированной группе, значительно больше, чем в неинфицированной контрольной группе (путем анализа дисперсии [ANOVA] с расщепленный график, P = 0,018). Значимость Холм-Шидака между результатами для инфицированных и контрольных групп увеличивалась со временем; (P = 0,14 и 0,13), они приблизились к значению через 10 мин (P = 0,055), и они были значительно различны (P

Превращение 13C18O в массу 47 (13C18OO газа) M. bovis Ravenel-инфицированных кроликов. Подробные методы описаны в материалах и методах. Выдыхаемый дыхание измеряли для определения δ47. ● инфицированные кролики; □, неинфицированные кролики. Данные представляют отдельные данные для отдельных животных, при этом бар представляет собой среднее значение. Разделенный график ANOVA использовался как мера эффектов между субъектами (неинфицированные и инфицированные), а склоны были значительно различны (P = 0,018). Отдельные временные точки сравнивались между инфицированными и контрольными животными с использованием однонаправленного ANOVA с тестом Холма-Шидака в качестве пост-hoc-теста.

Мы продемонстрировали, что тесты на основе CODH на основе стабильного изотопа дают возможность быстро обнаруживать туберкулезные микобактерии in vitro и in vivo. В то время как дополнительная чувствительность, получаемая при использовании двойной метки 13C18O, позволила успешно выявлять in vivo, потенциал для опосредованной карбоангидразой потери 18O из результирующего 13C18O16O влечет за собой использование ацетазоламида или подобного препарата. Ключевым преимуществом теста дыхания CODH над тестом на дыхание уреазы (6) является вероятность очень высокой специфичности по сравнению с тестом на уреазу. Многие важные легочные патогены экспрессируют уреазу (табл. 1), и поэтому уреаза может привести к ложному положительному результату при диагностике туберкулеза. Ни одна из этих (Таблица 1) или любые другие признанные патогены легких не обладают генами для CODH или, как было показано, окисляют CO до CO2. Таким образом, хотя активность уреазы может обеспечить быстрый экран POC для последующей диагностики ТБ или подходящего биомаркера для мониторинга лечения у уже диагностированных больных туберкулезом, тест на дыхание CODH имеет потенциал для быстрой диагностики туберкулеза с помощью POC. Однако ясно, что повышенная специфичность обнаружения CODH обусловлена ​​снижением чувствительности по сравнению с обнаружением уреазы.

Ключевой проблемой при переходе на процедуру клинических исследований будет необходимость уравновешивать потребность в вдыхании достаточного газа 13C18O, чтобы улучшить чувствительность с необходимостью поддерживать достаточно низкие уровни карбоксигемоглобина для поддержания безопасности. Повышение чувствительности обнаружения 13C18O16O в значительной степени поможет сбалансировать эти противоположные требования. Потенциальной альтернативой было бы использование микродозы 14CO с обычным подсчетом, как это было сделано для испытания на уреазу (25), или для использования более чувствительных, потенциально переносимых альтернатив к масс-спектрометрии ускорителя (MS) (26). Такие подходы также устраняют необходимость предварительной обработки ацетазоламидом из-за их независимости от обмена атомов кислорода. Для использования с биомаркером ответа на лечение в испытаниях на лекарственные средства централизованный ускоритель MS может быть осуществимым, причем время отчетности зависит от транспортировки проб.

Становится все более очевидным, что исходящий из хозяина CO из гем оксигеназы, помимо потенциально используемого в качестве диагностического инструмента, является важным модулятором микобактериальной сигнализации (27, 28) и участвует в микобактериальном контроле (29, 30) в что представляется клинически важным (31). Тем не менее, далеко не ясно, как разрешить различные эффекты СО, поскольку он может функционировать как в качестве принимающего хозяина контроллера микобактериальной сигнализации, так и в качестве источника энергии микобактерий, происходящего у хозяина. Несмотря на то, что достижения в области цельноклеточных метаболитов через ядерный магнитный резонанс (ЯМР) позволяют провести мощный анализ эффектов лекарственного средства в культурах (32), в настоящее время эти методы подходят только для культуры. Способность изучать in situ в принимающей среде фенотип CODH, разработанный здесь, поможет в разрешении этой головоломки. Кроме того, эта работа демонстрирует, что даже сложные бактериальные фенотипы метаболизма могут быть обнаружены и исследованы in situ в организме хозяина с помощью соответствующих химикатов для маркировки и обнаружения.

Немаркированный CO-газ был приобретен у Sigma-Aldrich, а газы 13CO и 13C18O были приобретены в Лаборатории Кембриджского изотопа (Andover, MA) и были сжаты. 7H9 была приобретена у BD (Franklin Lakes, NJ). Детектор СО (детектор окиси углерода Fluke, Cole-Parmer, Vernon Hills, IL) был приобретен у Fisher Scientific (Питтсбург, штат Пенсильвания). Если не указано иное, другие реагенты были приобретены у Sigma-Aldrich. Соотношение изотопов MS (IRMS) проводили с использованием спектрометра DELTAplusXL (Thermo Scientific Inc., Waltham, MA).

Культуры микобактерий получали путем оттаивания аликвот замороженных продуктов Mycobacterium tuberculosis H37Rv, M. bovis Ravenel или M. bovis BCG, как описано ранее для экспериментов по уреазе (6). Их выращивали аэробно при 37 ° С в жидкой среде 7H9 Middlebrook, дополненной олеиновой кислотой, альбумином, декстрозой и каталазой (Becton, Dickinson, Inc., Sparks, MD), 0,5% глицерина и 0,05% Tween 80. M. bovis БЦЖ выращивали в той же культуральной среде, но без олеиновой кислоты.

Три миллилитра микобактериальной культуры в течение 2-3 дней приближающейся стационарной фазы (из предыдущих кривых роста, полученных с использованием оптической плотности при 600 нм) выращивали аэробно и инкубировали с CO на воздухе в 12-мл флаконах Exetainer с резиновыми перегородками (Labco Ltd ., Ceredigion, United Kingdom) в течение 1 часа при 37 ° C с вращательным встряхиванием при 250 об / мин, если не указано иначе, используя культуральную среду, как указано выше. CO был введен через перегородки газовым шприцем после извлечения того же объема воздуха для поддержания атмосферного давления. Полученный газообразный объемный запас (1 мл) аналогичным образом получали после инъекции 1 мл воздуха, с двойным фильтром через 0,25 мкм шприцевые фильтры и переносили в флаконы Exetainer с гелием для IRMS. Если не указано иное, инкубацию проводят в течение 30 мин с добавлением 1 мл газа CO.

Определение проводилось с помощью масс-спектрометрии отношения изотопов газа (DELTAplusXL, Thermo Scientific Inc., Waltham, MA). В качестве эталонного газа использовали необогащенный газ CO2 (Matheson Tri-Gas, Albuquerque, NM). Для обнаружения конверсии 13CO в 13CO2 мы использовали IRMS, как описано выше (6), и сообщаем об обогащении в свободном пространстве 13CO2, используя стандартную нотацию δ-13C (33). Для обнаружения конверсии 13C18O-13C18O16O мы измеряли относительные отношения масс 47 (13C18O16O) и 44 (CO2) (rR47 / 44) и определяли δ47 как 1000 ⋅ [rR47 / 44 (образец) — rR47 / 44 (стандарт) ], деленный на rR47 / 44 (стандарт).

Как обычно при стабильном изотопном дыхании, увеличение изотопного изобилия после введения трассера сообщается с тем, чтобы исправить незначительные отклонения в исходном состоянии, которые происходят естественным образом, и результат был назван Δ47, где Δ47 = δ47 (после СО) — δ47 (исходный уровень до СО). Из-за возможности большей дисперсии in vivo в исходных данных влиять на значения через ряд (из-за его постоянного вычитания из данных), δ47 представляется для данных кроликов.

Все протоколы были одобрены Институциональными комитетами по уходу и использованию животных в Университете Джона Хопкинса (номер протокола RB11M466). Исключенные без патогенов новорожденные новозеландские белые кролики (от 3,5 до 4,1 кг), полученные от Covance Research Products, Inc. (Денвер, штат Пенсильвания). Животных анестезировали для тестов на инфекцию и дыхание с помощью кетамина (от 15 до 25 мг / кг массы тела) и ксилазина (5-10 мг / кг). Сторнирование седации было достигнуто йохимбином (от 0,1 до 0,2 мг / кг). Кроликов заражали интратрахеальной инсерцией бактериальной суспензии, содержащей 106 клеток Mycobacterium bovis Ravenel, с использованием питающей трубки через вставленную педиатрическую эндотрахеальную трубку. Кролика сохраняли после заражения с правой стороны и поднимали голову до отмены седации. Кролики были протестированы через 4 недели после заражения или фиктивной инфекции. Клинические признаки и симптомы поддерживали инфекцию, при этом неинфицированные кролики получали 0,4, 0,4 и 0,6 кг, а инфицированные кролики теряли 0,1, 0,6 и 0,3 кг за одно и то же время (P

Кролики предварительно обрабатывали ацетазоламидом (AZZ) (80 мг / кг) для ингибирования опосредованной карбоангидразой изотопного скремблирования 13C18O16O-13C16O16O. Затем анестезированных кроликов обрабатывали респираторным пакетом (общим объемом 750 мл), соединенным со вставленной эндотрахеальной трубкой для доставки моноксида углерода (СО). СО вводили шприц в респираторный мешок, который поддерживали в течение 1 мин, до того, как образцы воздуха были взяты в течение нескольких минут (5, 10 и 15 мин после удаления респираторного мешка). Затем через эндотрахеальную трубку вводили 14-ю французскую питательную трубку, соединенную с 30-мл шприцем, до уровня киля для аспирации выдыхаемого воздуха. АЗЗ (80 мг / кг) вводили внутривенно за 5 мин до обработки СО, и было взято 5 исходных проб газа. Выдыхаемый газ для дыхания фильтровали с помощью мембранных фильтров 0,35 мкм в воздушные пакеты (Otsuka, Япония), а затем герметизировали вакуумные трубки (Becton, Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Для IRMS отфильтрованные образцы переносили на флаконы Exetainer с промытым гелием.

Ниже уровня насыщения карбоксигемоглобина примерно на 20% эффекты на координацию человека умеренные (34) и ниже 11-13%, никаких эффектов не обнаружено (35), поэтому мы нацелились на дозу СО, которая привела бы к менее чем 20% но более чем у 11% карбоксигемоглобина у кроликов. После расчета мы вводили 30 мл газа 13C18O в респираторный мешок, наполненный 500 мл воздуха в течение 1 мин (5,7% СО, общее облучение, 0,475% в час эквивалента), а затем удаляли его и позволяли кроликам вдыхать воздух в помещении. Выдыхаемое дыхание было собрано от 0 до 15 минут после доставки СО. Соотношение насыщения СО оценивалось по концентрации в выдыхаемом воздухе (36) и варьировалось от 9,3 до 18,2%. Кролики не проявляли никакого ненормального поведения; клинические респираторные симптомы были нормальными. Поэтому мы использовали эту дозу при последующих испытаниях на дыхание. Расширенные исследования дыхания 0,19% СО (5 ч, 0,95% в час эквивалента) не показали морфологических изменений в легких кролика (37).

Все числа являются средними значениями ± стандартными отклонениями (SD) от независимых биологических повторов, с n и статистическим критерием, описанным в соответствующих легендах фигуры. Для исследований in vitro биологические репликации были одних и тех же культур, но разделены на независимые трубки Exetainer, причем газы из каждой пробирки анализировались индивидуально. Для исследований in vivo биологические репликации были отдельными животными, которые либо были инфицированы (n = 3), либо неинфицированы (n = 3). Индивидуальные моменты времени сравнивались с использованием одностороннего ANOVA с последующим сравнением Holm-Šidák. Разделительный график ANOVA использовался как мера эффектов между субъектами (неинфицированные и инфицированные).

Цитирование Maiga M, Чой SW, Atudorei V, Maiga MC, Sharp ZD, Bishai WR, Timmins GS. 2014. Исследования in vitro и in vivo быстрого и выборочного теста на дыхание для туберкулеза на основе микобактериальной дегидрогеназы. mBio 5 (2): e00990-14. DOI: 10,1128 / mBio.00990-14.



Источник: rupubmed.com


Добавить комментарий